【摘要】目的 针对术后手术部位感染（SSI）中脓性分泌物样本高黏度、高宿主DNA背景及微生物组成复杂等特点，建立一套标准化、可重复的纳米孔实时测序技术（NTS）快速病原体鉴定检测流程（RAPIDPUS），并构建适用于该类特殊样本的完整操作体系，为后续诊断性能评价及多中心验证提供方法学基础。方法 本研究为单中心、探索性方法学研究。采用方法学优化与流程验证相结合的设计：（1）系统优化前处理方案，重点比较不同物理破壁方式、酶学裂解策略及宿主DNA去除方法对微生物核酸释放效率与信号富集效果的影响；（2）建立涵盖样本前处理、微生物核酸富集、DNA提取、快速建库、实时测序及生物信息学分析的完整流程；（3）明确测序时间窗口与病原体判读标准；（4）拟通过后续临床来源脓性分泌物样本验证优化后流程的稳定性、可行性及病原识别能力，并初步探索其与传统培养方法的互补价值。结果 通过方法学比较，确定了更适用于脓性分泌物样本的前处理优化方案，有效提升了微生物核酸获取效率并降低了宿主背景干扰。在此基础上，成功构建了从样本处理到数据分析的标准化纳米孔测序操作体系，明确了关键流程参数（包括测序时长和生物信息学分析阈值），该体系在后续临床样本验证中表现出良好的流程稳定性和病原体检测可行性，并能初步检出传统培养法未覆盖或难培养的潜在致病性微生物，显示出两种方法的互补潜力。结论 本研究成功建立了针对术后脓性分泌物的纳米孔实时测序快速病原鉴定标准化流程（RAPIDPUS），该体系可稳定运行且能有效识别病原体，有望弥补传统培养法在复杂感染场景中的不足。然而，其诊断准确性、临床获益及广泛适用性尚需通过更大规模、前瞻性的临床研究及多中心协作进一步验证。